近日，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)豬遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室黃路生院士團(tuán)隊(duì)在國際知名學(xué)術(shù)期刊《Trends in Biotechnology》（Cell Press 旗下，5年影響因子16.6）發(fā)表了題為“Highly efficient prime editors for mammalian genome editing based on porcine retrovirus reverse transcriptase”的重要研究成果。該研究基于豬基因組中的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄酶元件，成功開發(fā)出一套高效、精準(zhǔn)、安全、多物種適用的新型先導(dǎo)編輯（Prime editing）系統(tǒng)—pvPE。我校黃路生院士、幸宇云研究員與劉為偉博士后（兼第一作者）為通訊作者，博士研究生段文鑫為共同第一作者。

      研究背景：

先導(dǎo)編輯（Prime editing, PE）是近年來由基因編輯領(lǐng)域國際知名科學(xué)家David Liu團(tuán)隊(duì)率先開發(fā)、并獲得迅速發(fā)展的新型基因組編輯技術(shù)，可以在不引起DNA雙鏈斷裂的情況下實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的插入、替換和缺失等多種編輯類型，被譽(yù)為“萬能型”基因編輯工具。然而，該技術(shù)目前僅在HEK293T等少數(shù)細(xì)胞系中展示出較高的效率，在豬等大型農(nóng)業(yè)動物中的編輯效率比較低下，成為限制其廣泛應(yīng)用的重要因素。逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）作為PE系統(tǒng)的核心組分，其活性是影響編輯效率的關(guān)鍵。目前主流PE系統(tǒng)采用的逆轉(zhuǎn)錄酶主要來源于鼠白血病病毒（MMLV），國際上雖有不少課題組嘗試挖掘新的RT用于PE系統(tǒng)，但效率始終未能超越基于工程化的MMLV-RT。因此，開發(fā)高活性的全新RT成為推動PE技術(shù)突破，尤其是將其應(yīng)用于家豬等大動物基因編輯的迫切需求。

豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（PERV）序列是進(jìn)化過程中整合到豬基因組中的病毒基因組遺跡，在豬體內(nèi)已存在數(shù)百萬年。現(xiàn)有研究表明，PERV具有多個亞型，在不同個體及同一個體不同器官中的拷貝數(shù)均可能存在差異，體現(xiàn)出豐富的基因組多樣性，為新型RT的開發(fā)提供了獨(dú)特的資源。

主要研究內(nèi)容：

研究團(tuán)隊(duì)首先對全球不同豬種PERV-RT序列進(jìn)行系統(tǒng)研究，篩選出86個變體，并利用熒光報告系統(tǒng)評估其活性，發(fā)現(xiàn)一條來自中國巴馬香豬的C型PERV-RT活性最強(qiáng)；由此構(gòu)建的pvPE-V1編輯器，較David Liu第一代編輯器PE1的平均效率提升1.28倍。隨后，通過系統(tǒng)性篩選有益氨基酸突變位點(diǎn)、對PERV-RT重要功能元件進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化以及融合有益功能模塊等手段，將pvPE-V1逐步升級為pvPE-V2、pvPE-V3和pvPE-V4。

高級版本的pvPE-V4與pvPE-V1相比，在人類HEK293T細(xì)胞、豬胎兒成纖維細(xì)胞（PFFs）、犬胎兒成纖維細(xì)胞（CFFs）和羊胎兒成纖維細(xì)胞（SFFs）中的編輯效率平均提升24.38-101.69倍；與國際上最新開發(fā)的基于鼠源RT的PE7系統(tǒng)相比，不僅編輯效率提高了47%，且副產(chǎn)物比例顯著更低。此外，該研究還首次發(fā)現(xiàn)小分子藥物諾考達(dá)唑（Nocodazole，Noc）可顯著提升PE效率，并通過轉(zhuǎn)錄組測序，揭示其可能通過調(diào)控細(xì)胞周期抑制錯配修復(fù)途徑發(fā)揮作用。

利用所創(chuàng)建的高效pvPE系統(tǒng)，針對人類阿爾茨海默病（AD）三大家族性致病突變 APPKM670/671NL、PSEN1M146L 和 TAUP301L ，在PFFs中實(shí)現(xiàn)了高效的多基因同步編輯，其中TAUP301L的編輯效率達(dá)95%，兩位點(diǎn)與三位點(diǎn)同步編輯的效率達(dá)45%。此外，以三位點(diǎn)同步編輯的PFFs為供體細(xì)胞開展體細(xì)胞核移植，成功獲得19頭存活的AD模型豬。10月齡時，該模型豬可檢測到AD兩大病理表型—β淀粉樣蛋白沉積和Tau蛋白磷酸化，這是國際上首次在豬模型中同時復(fù)現(xiàn)這兩大AD核心病理標(biāo)志。同時，利用全基因組脫靶檢測技術(shù)，在模型豬中未檢測到脫靶事件，進(jìn)一步凸顯pvPE系統(tǒng)的安全性。

研究意義：

Cas核酸酶與逆轉(zhuǎn)錄酶是PE技術(shù)的兩大核心元件。近年來，我國科研團(tuán)隊(duì)在Cas核酸酶領(lǐng)域取得了一系列國際領(lǐng)先的成果，但在逆轉(zhuǎn)錄酶這一對編輯效率同樣重要的關(guān)鍵元件開發(fā)上研究較少，亟待突破。研究團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新性地從豬基因組中挖掘內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄酶元件，實(shí)現(xiàn)了對PE技術(shù)的重要升級與拓展。新開發(fā)的pvPE系統(tǒng)具有編輯效率更高、適用物種更廣、副產(chǎn)物率更低、安全性更好等突出優(yōu)勢，在不同類別哺乳動物細(xì)胞生物學(xué)研究、動物疾病模型構(gòu)建以及異種器官供體家豬制備等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價值與廣闊前景。研究團(tuán)隊(duì)研制的pvPE基因編輯系統(tǒng)已申請國內(nèi)、國際外專利，專利號分別為：CN202410635868.2，PCT/CN2024/094408。